Az ultraszűrő centrifugacső használata és óvintézkedései
1) Válasszon egy megfelelő ultraszűrő csövet.Vegye figyelembe, hogy az UF membránok különböznek a különböző vegyi anyagokkal szembeni tolerancia szintjében.Általában a 10 kDa molekulatömeg-határértékkel rendelkező ultraszűrő csöveket olyan molekulatömeg-határértékkel lehet kiválasztani, amely nem lehet nagyobb, mint a kérdéses fehérje molekulatömegének 1/3-a, például 35 kDa.Ha a kérdéses fehérje molekulatömege 10 kd körül van, akkor 3 KD molekulatömeg-határértékkel rendelkező ultraszűrő cső használható.
(2) A frissen vásárolt ultraszűrő száraz, használat előtt ultratiszta vizet adnak hozzá, és néhány percig előhűtött víz teljesen áthalad a membránon, a jégfürdőn vagy a hűtőszekrényen.Ezután leöntjük a vizet, vagyis a fehérjefolyadékot, és mennyit adunk hozzá, attól függően, hogy melyik nem több, mint a cső tetején lévő fehér vonal.A művelet könnyű, és az ultraszűrő csövet jégre kell hűteni a fehérjeoldat hozzáadása előtt.
3) Mind a tömegnek, mind a súlypontnak el kellett érnie az egyensúlyt.Vegye figyelembe, hogy a forgási sebesség és a gyorsulás nem túl gyors, különben közvetlenül károsítja az ultraszűrő membránt.Megkezdtük a centrifugális ultraszűrést (4 fokra előhűtött centrifuga).Miután a különböző centrifugák fordulatszámát g-re konvertáltuk, más volt.A centrifuga gyorsulását minimálisra állítottuk, csökkentve a membránra nehezedő nyomást.Ne feledje, feltétlenül hagyja el a centrifugát, miután a centrifuga elérte a rendeltetési sebességét, vagy ha problémája van, első alkalommal nem tudja kezelni.A membrán orsóhoz viszonyított orientációját az utasításoknak megfelelően állítottuk be (a szögletes centrifugaház a membrán tengelyére merőleges).A gyakorlati használat során az általános forgási sebesség alacsonyabb, mint a használati utasításban, így a centrifugacső élettartama meghosszabbítható.
3) Mind a tömegnek, mind a súlypontnak el kellett érnie az egyensúlyt.Vegye figyelembe, hogy a forgási sebesség és a gyorsulás nem túl gyors, különben közvetlenül károsítja az ultraszűrő membránt.Megkezdtük a centrifugális ultraszűrést (4 fokra előhűtött centrifuga).Miután a különböző centrifugák fordulatszámát g-re konvertáltuk, más volt.A centrifuga gyorsulását minimálisra állítottuk, csökkentve a membránra nehezedő nyomást.Ne feledje, feltétlenül hagyja el a centrifugát, miután a centrifuga elérte a rendeltetési sebességét, vagy ha problémája van, első alkalommal nem tudja kezelni.A membrán orsóhoz viszonyított orientációja az utasításoknak megfelelően lett beállítva (a szögletes centrifugaház a membrán tengelyére merőleges).A gyakorlati használat során az általános forgási sebesség alacsonyabb, mint a használati utasításban, így a centrifugacső élettartama meghosszabbítható.
(4) Ha a maradék 1 ml-re koncentráltuk, vegyen be 50 ul pufferoldatot, adjon hozzá 10 ul átfolyó folyadékot, és nézze meg, van-e kék szín, annak megítéléseképpen, hogy az ultraszűrő csőből hiányzik-e a fehérje.Ha a cső szivárog, öntse újra a felső réteget, és öntse át egy új csőbe az ultraszűrés megkezdéséhez.Annak meghatározásához, hogy a csöveket kihagyták-e, centrifugáljon 10 percig 5 mg BSA-val az átfolyás előtt, fehérjeragasztón futtatva vagy bradfordi nyers tesztben, és folytassa a maradék koncentrált fehérjeoldat hozzáadásával (amely jégen működik, és megakadályozza a fehérjék felmelegedését), amíg az összes koncentrátumot hozzáadtuk.Legyen óvatos a centrifugálás során, ha fehérjék kicsapódnak, ami a cső bezárásához vezet.Ha csapadék jelentkezik, határozza meg, hogy a kicsapódás konkrét oka a túlzott fehérjekoncentráció vagy a nem megfelelő puffer;Az előbbi több ultraszűrőcső egyidejű ultraszűrésével, a koncentráció csökkentésével, az utóbbi pedig különböző pufferoldatok cseréjével oldható meg, amíg a fehérje kicsapódása nem következik be.
(4) Ha a maradék 1 ml-re koncentráltuk, vegyen 50 ul pufferoldatot, adjon hozzá 10 ul átfolyót, és ellenőrizze, hogy nincs-e kék szín, annak megítélésére, hogy az ultraszűrő csőből hiányzik-e a fehérje.Ha a cső szivárog, öntse újra a felső réteget, és öntse át egy új csőbe az ultraszűrés megkezdéséhez.A csövek kihagyásának pontos meghatározásához centrifugáljon 10 percig 5mgml BSA-val az átfolyás előtt, fehérjeragasztón futtatva vagy Bradford nyers vizsgálattal, majd folytassa a maradék koncentrált fehérjeoldat hozzáadásával (amely jégen működik, és megakadályozza a fehérjék felmelegedését), amíg az összes koncentrátumot hozzáadtuk.Legyen óvatos a centrifugálás során, ha fehérjék kicsapódnak, ami a cső bezárásához vezet.Ha csapadék jelentkezik, határozza meg, hogy a kicsapódás konkrét oka a túlzott fehérjekoncentráció vagy a nem megfelelő puffer;Az előbbi több ultraszűrőcső egyidejű ultraszűrésével, a koncentráció csökkentésével, az utóbbi pedig különböző pufferoldatok cseréjével oldható meg, amíg a fehérje kicsapódása nem következik be.
(5) Az első néhány lépést a fehérje koncentrálására használjuk, és ha a puffert módosítani kell, óvatosan adjunk hozzá új puffert (ultraszűrés egy 0,22 um ultraszűrő membránon keresztül) körülbelül 1 ml teljes fehérjéhez, majd koncentráljuk újra körülbelül 1 ml-re háromszor. egymást követő alkalommal, a végső koncentrált végső térfogat a kívánt fehérjekoncentrációtól függően általában nem több, mint 500 ul, de 200 ul-en belül is.Három alkalommal 1000-szeres vagy több érték elérése, lényegében annyi pufferváltozás, amennyit minden alkalommal legalább 10-szeres térfogatdúsítással számolunk.
(5) Az első néhány lépést a fehérje koncentrálására használjuk, és ha a puffert módosítani kell, óvatosan adjunk hozzá új puffert (ultraszűrés egy 0,22 um ultraszűrő membránon keresztül) körülbelül 1 ml teljes fehérjéhez, majd koncentráljuk újra körülbelül 1 ml-re háromszor. egymást követő alkalommal, a végső koncentrált végső térfogat a kívánt fehérjekoncentrációtól függően általában nem több, mint 500 ul, de 200 ul-en belül is.Három alkalommal 1000-szeres vagy több érték elérése, lényegében annyi pufferváltozás, amennyit minden alkalommal legalább 10-szeres térfogatdúsítással számolunk.
Feladás időpontja: 2022.11.09