PCR, a polimeráz láncreakció, amely dNTP, Mg2+, elongációs faktorok és amplifikációfokozó faktorok hozzáadását jelenti a rendszerhez a DNS-polimeráz katalízise alatt, az anya-DNS-t templátként és specifikus primereket használva a kiterjesztés kiindulópontjaként. A denaturálás, az annealizálás, az extenzió stb. lépései révén a szülői szál templát DNS-sel komplementer leányszálú DNS in vitro replikációja gyorsan és specifikusan amplifikálhat bármilyen cél DNS-t in vitro.
1. Hot Start PCR
A hagyományos PCR-nél az amplifikáció kezdő időpontja nem az, hogy a PCR-gépet a PCR-gépbe helyezzük, majd a program amplifikálni kezd.Amikor a rendszer konfigurálása befejeződött, megkezdődik az amplifikáció, ami nem specifikus amplifikációt okozhat, és a hot-start PCR megoldhatja ezt a problémát.
Mi az a hot start PCR?A reakciórendszer elkészítése után az enzimmódosítót magas hőmérsékleten (általában 90 °C-nál magasabban) szabadítják fel a reakció kezdeti melegítési szakaszában vagy a „hot start” szakaszban, így a DNS-polimeráz aktiválódik.A pontos aktiválási idő és hőmérséklet a DNS polimeráz és a hot-start módosító természetétől függ.Ez a módszer főként módosítókat, például antitesteket, affinitásligandumokat vagy kémiai módosítókat használ a DNS-polimeráz aktivitásának gátlására.Mivel a DNS polimeráz aktivitása szobahőmérsékleten gátolt, a hot start technológia nagy kényelmet biztosít több PCR reakciórendszer szobahőmérsékleten történő előállításához anélkül, hogy a PCR reakciók specifitását feláldozná.
2. RT-PCR
Az RT-PCR (reverz transzkripciós PCR) egy kísérleti technika az mRNS-ből cDNS-be történő reverz transzkripciójára, és templátként történő felhasználására az amplifikációhoz.A kísérleti eljárás abból áll, hogy először a teljes RNS-t kinyerjük szövetekből vagy sejtekből, Oligo-t (dT) használunk primerként, reverz transzkriptázt használunk a cDNS szintéziséhez, majd cDNS-t használunk templátként a PCR-amplifikációhoz a célgén megszerzéséhez vagy a génexpresszió kimutatásához.
3. Fluoreszcens kvantitatív PCR
Fluoreszcens kvantitatív PCR (valós idejű kvantitatív PCR,RT-qPCR) a fluoreszcens csoportok PCR reakciórendszerhez való hozzáadásának módszerére utal, a fluoreszcens jelek felhalmozásával a teljes PCR-folyamat valós idejű nyomon követésére, végül pedig a standard görbe használatával a templát kvantitatív elemzésére.Az általánosan használt qPCR módszerek közé tartozik a SYBR Green I és a TaqMan.
4. Beágyazott PCR
A beágyazott PCR két PCR primer készlet használatát jelenti a PCR amplifikáció két köréhez, és a második kör amplifikációs terméke a célgén fragmentum.
Ha az első pár láncindító (külső láncindítók) eltérése egy nem specifikus termék amplifikációját okozza, nagyon kicsi annak a lehetősége, hogy ugyanazt a nem specifikus régiót felismerje a második primerpár, és folytassa az amplifikációt, így a A második primerpárral történő amplifikáció, a PCR specifitása javult.A két PCR végrehajtás egyik előnye, hogy segít elegendő mennyiségű terméket amplifikálni korlátozott mennyiségű kiindulási DNS-ből.
5. Touchdown PCR
A Touchdown PCR egy módszer a PCR-reakció specifitásának javítására a PCR ciklus paramétereinek beállításával.
A touchdown PCR-ben az első néhány ciklusban az annealing hőmérsékletet néhány fokkal a primerek maximális annealing hőmérséklete (Tm) fölé állítják.Magasabb összekapcsolási hőmérséklet hatékonyan csökkentheti a nem specifikus amplifikációt, ugyanakkor a magasabb összekapcsolási hőmérséklet súlyosbítja a primerek és a célszekvenciák elválasztását, ami csökkenti a PCR-hozamot.Ezért az első néhány ciklusban az illesztési hőmérsékletet általában ciklusonként 1 °C-kal csökkentik, hogy növeljék a célgén tartalmát a rendszerben.Amikor az izzítási hőmérsékletet az optimális hőmérsékletre csökkentik, a lágyítási hőmérséklet a fennmaradó ciklusokban megmarad.
6. Közvetlen PCR
A közvetlen PCR a cél DNS amplifikációját jelenti közvetlenül a mintából anélkül, hogy nukleinsav izolálásra és tisztításra lenne szükség.
A közvetlen PCR két típusa létezik:
közvetlen módszer: vegyen egy kis mennyiségű mintát, és adja hozzá közvetlenül a PCR Master Mix-hez a PCR azonosításhoz;
krakkolási módszer: a minta mintavétele után adjuk hozzá a lizátumhoz, lizáljuk a genom felszabadulásához, vegyünk egy kis mennyiségű lizált felülúszót és adjuk hozzá a PCR Master Mix-hez, végezzük el a PCR azonosítást.Ez a megközelítés leegyszerűsíti a kísérleti munkafolyamatot, csökkenti a gyakorlati kezelési időt, és elkerüli a DNS-vesztést a tisztítási lépések során.
7. SOE PCR
Az átfedő láncok kiterjesztésével történő génillesztés (SOE PCR) komplementer végekkel rendelkező primereket használ, hogy a PCR-termékek átfedő láncokat alkossanak, így a következő amplifikációs reakcióban az átfedő láncok meghosszabbítása révén az A technika különböző forrásai, amelyekben az amplifikált fragmensek átfedésben vannak. és összeillesztik.Ennek a technológiának jelenleg két fő alkalmazási iránya van: fúziós gének felépítése;génhelyre irányított mutáció.
8. IPCR
Az inverz PCR (IPCR) reverz komplementer primereket használ a két primertől eltérő DNS-fragmensek amplifikálására, és egy ismert DNS-fragmens mindkét oldalán ismeretlen szekvenciákat amplifikál.
Az IPCR-t eredetileg a szomszédos ismeretlen régiók szekvenciájának meghatározására tervezték, és többnyire génpromoter szekvenciák tanulmányozására használják;onkogén kromoszóma-átrendeződések, például génfúzió, transzlokáció és transzpozíció;és a vírus génintegrációja szintén általánosan használatos manapság A helyspecifikus mutagenezishez másoljon le egy plazmidot a kívánt mutációval.
9. dPCR
A digitális PCR (dPCR) a nukleinsavmolekulák abszolút mennyiségi meghatározására szolgáló technika.
Jelenleg három módszer létezik a nukleinsavmolekulák mennyiségi meghatározására.A fotometria a nukleinsavmolekulák abszorbanciáján alapul;a valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR (Real Time PCR) a Ct-értéken alapul, a Ct-érték pedig a kimutatható fluoreszcenciaértéknek megfelelő ciklusszámra vonatkozik;A digitális PCR a legújabb kvantitatív technológia, amely az egymolekulás számláláson alapul. A nukleinsavak számszerűsítése abszolút kvantitatív módszer.
Feladás időpontja: 2023. június 13